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《mRNA-LNP疫苗的结构与稳定性》文献解读系列四

发布时间:2021-09-01   点击次数:90次

mRNA疫苗的体外稳定性

正如之前在背景介绍中提到的,目前已批准的 mRNA疫苗流通的主要障碍之一是它们必须以冷冻形式储存。在 2–8 °C 的温度下,辉瑞/BioNTech 和 Moderna 疫苗分别可稳定保存 5 天和 30 天,两家公司都为终端使用提供了详细的处理说明。有趣的是,据报道 CureVac 的候选疫苗在冰箱温度和 -60 °C 下可稳定 3 个月。这些是目前发布了mRNA-LNP长期储存条件的制造商,这种苛刻的温度要求严重影响了这些疫苗的储存、运输和流通。然而,迄今为止,在公开资料中几乎没有关于优化mRNA 疫苗稳定性的信息。本节旨在概述影响 mRNA-LNP 疫苗成分稳定性的因素,并讨论分析评价这种稳定性的方法。


mRNA稳定性

强烈影响所需储存条件的主要因素是 mRNA 的稳定性。如上文2.1 节所述,mRNA 分子的结构经过专门设计可以用于增加体内靶抗原的翻译。mRNA 的特殊性在于,即使是长 mRNA 链(通常长度在 1000 到 5000 个核苷酸之间)中的一个核苷酸发生变化(链断裂或碱基氧化)便会导致翻译终止。这使得 mRNA 疫苗与其他疫苗完全不同,在其他疫苗中,抗原的微小变化不一定对其功效产生显影响。因此,对于 mRNA 疫苗,监测整个分子的完整性是至关重要的。


mRNA 降解的方式有多种,可以分为化学和物理降解。化学降解包括 mRNA 分子中化学键的改变。物理不稳定性包括变性(二级和三级结构的丧失),与变性对蛋白质生物制剂活性的影响不同,物理不稳定性对mRNA的影响可能不太明显。然而,变性还包括聚集和沉淀等变化,这些变化会影响mRNA的翻译表达。在一篇关于核酸稳定性的综述中,Pogocki 和 Schöneich 指出化学降解在siRNA降解中的影响比物理不稳定性更大,对于链长更长的 mRNA来说可能更是如此。


mRNA在体外的化学降解主要包括水解和氧化,水解主要是发生在mRNA 分子骨架的磷酸二酯键(图5 )。核糖上的2' OH 基团起着至关重要的作用,因为导致 mRNA 链断裂的酯交换反应起始于磷酸酯键上的 2'OH 基团的亲核进攻导致 P-O5' 酯键断裂(图5)。这个过程需要水,可以被核酸酶催化,也可以被 mRNA 分子本身和其他外源因素如酸和碱催化。在有关 mRNA 水解的两篇文献中,作者指出 mRNA 的碱基序列和二级结构会影响水解速率。具体而言,碱基堆积可能会降低磷酸二酯键的裂解速率,可以小化 mRNA 分子的“平均未配对概率"。可以使用专门设计的算法来选择可以形成大双链区域的单链 mRNA 的核苷酸序列。据称,采用这种方法优化后,体外稳定性得到了改善。


CureVac、辉瑞/BioNTech 和 Moderna 疫苗之间的区别在于后两者具有 1-甲基-假尿苷的单核苷掺入。之前的一项研究表明,这种修饰提高了 RNA 二级结构的稳定性。CureVac 采用提高GC比例策略,具有类似的效果。

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图5 通过 2',3'-环状磷酸酯,碱基催化RNA分子内的磷酸二酯键水解、B表示Brønsted碱。


相反,氧化会影响碱基,并在较小程度上影响mRNA 核糖单位的糖基团。氧化可导致碱基裂解、链断裂和 mRNA 二级结构的改变。然而,如前所述,水解似乎被认为是驱动 mRNA 降解的关键因素。



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