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DOTMA在脂质体转染实验中的实验步骤浅析

发布时间:2021-08-06   点击次数:100次

本篇文章AVT来介绍一下DOTMA在脂质体转染实验中的实验步骤。



脂质体转染实验步骤


脂质体(LR)试剂是阳离子脂质体DOTMA和DPE的混合物(1:1)。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中,是目前条件下方面的转染方法之转染率高,优于磷酸钙法,比它高5-100倍,能把DNA和RNA转染到各种细胞。用LR进行转染时,首先需要优化转染条件,应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等,对每批LR都要做,先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间,DNA可从1-5ug和孵育时间6h,开始按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线,再选用LR和DNA两者的剂量,确定出转染时间,因LR对细胞有一定的毒性,转染时间以不超过24h为宜。

 细胞种类:C0-7、BHK、NIH-3T3、Hela和 Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。


 1、操作步骤(方法一)

 1)取6孔培养板,向每孔中加入2m1含(1-2)x105个细胞的培养基,37℃、18%C02培养基40%-60%汇合时。

 2)转染液制备:在聚苯乙烯管中制备以下两液(为转染1个空细胞所用的A液:用不含血清培养基稀释DNA使浓度为1-10ug,终量100u1。B液:用不含血清培养基稀释LR,使终浓度为2-50ug,终量100u1轻轻混合A液、B液,室温中置10-15min,稍后会岀现微浊现象,但并不妨碍转染

 3)转染准备:用2m1不含血清培养基漂洗2次,再加入1m1不含血清培养基

 4)转染:把AB复合物缓缓加入培养基中,摇匀,置37℃温箱中6-24h吸除无血清转染液,换入正常培养基继续培养

 5)其余处理:如观察、筛选、检测等与其他转染法相同

 6)注意:转染时切勿加血清,血清对转染效率有很大影响。


 2、快速脂质体转染法操作步骤(方法二)

 ●……将细胞以5x105个/孔接种于6孔板中培养24h,使其达到50%-60%板底面积。

 ●……在试管中配制DNA-脂质体复合物

a、在1m1无血清DMEM中稀释PSV1-neo质粒DNA或供体DNAb、旋转1s,再加入脂质体悬液,旋转。

c、室温下放置5-10min,使DNA结合在脂质体上。

 ●……弃去细胞中的旧液,用1m1无血清DMEM洗细胞1次后弃去,向每孔中直接加入1m1DNA-脂质体复合物,37℃培养3-5天再于每孔中加入含20%胎牛血清的DMEM,继续培养14-24h。吸出DEM-DNA-脂质体混合物加入新鲜含10%胎牛血清的DMEM,2m1/L,再培养24-48h。用细胞刮或消化法收集细胞,以备分析鉴定


 3、稳定的脂质体转染法

 ●……接种细胞同前述,细胞长至50%

 ●……DNA-脂质体复合物制备转染细胞同前。

 ●……在每孔中加入1m1含20%胎牛血清的DMEM,37℃培养48h。

 ●……吸出DEM,用G418选择性培养基稀释细胞,使细胞生长一定时间筛选转染克隆,方法参照细胞克隆筛选法进行。



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